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細(xì)胞色素C技術(shù)工作方法分享說明

更新時(shí)間:2018-10-27      點(diǎn)擊次數(shù):2599
   細(xì)胞色素C是一類含有鐵啉基團(tuán)的電子傳遞蛋白,只存在于需氧細(xì)胞中。細(xì)胞色素在線粒體內(nèi)膜上起傳遞電子的作用。細(xì)胞色素C是細(xì)胞色素一種。它在線粒體呼吸鏈上位于細(xì)胞色素B 和細(xì)胞色素氧化酶之間,是呼吸鏈的一個(gè)重要組成部分。每分子細(xì)胞色素C含有一個(gè)血紅素和一條多肽鏈。現(xiàn)已從許多來源獲得細(xì)胞色素C結(jié)晶,并已對100多種細(xì)胞色素C蛋白的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測定。
 
  細(xì)胞色素C 是以一種鐵卟啉為輔基的呼吸酶,廣泛存在于所有的需氧組織中。在心肌與其他做劇烈運(yùn)動的肌肉中含量zui為豐富。細(xì)胞色素C 位于線粒體的蛋白質(zhì)—脂質(zhì)絡(luò)合物中,分子量約為13000,肽鏈中含有19個(gè)賴氨酸殘基,為一堿性蛋白, 等電點(diǎn)(10.5~10.8)高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石為鋁酸鈉,它是一種陽離子交換劑,細(xì)胞色素C分子剛好進(jìn)入它的表面空隙。在pH7.5時(shí)細(xì)胞色素C 呈正電荷,它可與沸石分子上的鈉離子發(fā)生交換,從而被沸石吸附。裝入層析柱后,用25%硫酸銨洗脫,又可將細(xì)胞色素C 交換下來。硫酸銨主要是降低沸石對細(xì)胞色素C 的親和力。硫酸銨鹽析可明顯提高細(xì)胞色素C 純度,主要為去除雜蛋白。另外三氯乙酸可引起細(xì)胞色素C 變性和聚合,必須嚴(yán)格控制三氯乙酸用量。
 
  細(xì)胞色素C與材料試劑
 
  1、 設(shè)備:組織搗碎機(jī)、酸度計(jì)、離心機(jī)、分光光度計(jì)、層析柱、透析袋、磁力攪拌器、冰箱。
 
  2、 儀器:剪刀、燒杯、漏斗、濾紙、天平、玻璃棒、紗布、試管、膠頭滴管。
 
  3、 試劑:聯(lián)二亞硫酸鈉、硫酸、硫酸銨、三氯乙酸、人造沸石、氯化鋇、氯化鈉、氫氧化銨。
 
  4、 材料:新鮮豬心(2個(gè))。
 
  細(xì)胞色素C實(shí)驗(yàn)步驟
 
  1、預(yù)處理:健康豬心去脂肪等結(jié)締組織—→剪碎放入碎冰中(保護(hù)酶的活性,避免搗碎機(jī)破碎時(shí)使酶失活)—→放入生理鹽水中清洗去污—→稱重:燒杯80g ,燒杯+豬心=240g,(240-80)×1.5=240ml酸化水—→組織搗碎機(jī)勻漿10min (勻漿3min ,停5min ,為了保證搗碎機(jī)安全)
 
  2、提?。簲嚢韬箪o置2h —→四層紗布過濾后加入1.5倍酸化水于沉淀物中,在過濾后靜置2h —→放入冰箱保存過夜—→從冰箱中取出—→加2mol/L氨水調(diào)PH 至6.0,靜置30min ,過濾—→濾液加2mol/L氨水調(diào)PH 至7.5,靜置30min, 過濾
 
  3、吸附:加10%人造沸石(濾液為220ml )—→磁力攪拌器攪拌吸附1h —→蒸餾水洗3次—→0.2%NaCI 溶液洗3次—→濾出人造沸石待用
 
  4、洗脫:在柱中裝人造沸石體積的三分之二蒸餾水—→將沸石放入柱中—→裝滿25%硫酸銨溶液進(jìn)行洗脫,流速控制在2ml/min 以下, 收集紅色的洗脫液(沒分辨出紅色液體階段,收集了所有洗脫液)
 
  5、鹽析:在洗脫液(300ml )中慢慢加入固體硫酸銨75g, 邊加邊攪拌,使硫酸銨溶液的濃度為50%—→置4℃冰箱過夜—→過濾,收集濾液—→向過濾液中按22ml/L的量滴加濃度為20%的三氯乙酸溶液(過濾液和20%三氯乙酸溶液在4℃遇冷, 邊加邊攪拌, 加時(shí)要快, 防止局部蛋白質(zhì)變性)—→加完后分成8管,立即離心—→無明顯沉淀,再5000轉(zhuǎn)離心15min —→無明顯沉淀,向每只離心管加入2滴濃度為20%的三氯乙酸溶液—→再5000轉(zhuǎn)離心15min —→無明顯沉淀,實(shí)驗(yàn)結(jié)束
 
  6、透析 將上述溶解后的細(xì)胞色素C 裝入透析袋中, 放進(jìn)500ml 燒杯中(用磁力攪拌器攪拌),用去離子水透析, 除去硫酸根離子,15min 換水一次,換手3~4次后,檢查硫酸根離子是否已被除盡。檢查方法:取2ml 氯化鋇溶液加入試管中,滴加2~3滴透析外液至試管中,若出現(xiàn)白色沉淀,表示硫酸根離子未除盡,如果不出現(xiàn)沉淀,表示透析*。將透析液過濾, 收集濾液即為細(xì)胞色素C 粗品。 記錄此粗品的體積。
 
  實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/div>
 
  1、通過細(xì)胞色素C的制備,了解制備蛋白質(zhì)制品的一般原理和步驟
 
  2、掌握制備細(xì)胞色素C的操作技術(shù)及含量的測定方法
 
  實(shí)驗(yàn)原理:
 
  細(xì)胞色素是一類含有鐵啉基團(tuán)的電子傳遞蛋白,只存在于需氧細(xì)胞中。細(xì)胞色素在線粒體內(nèi)膜上起傳遞電子的作用。細(xì)胞色素C是細(xì)胞色素一種。它在線粒體呼吸鏈上位于細(xì)胞色素B和細(xì)胞色素氧化酶之間,是呼吸鏈的一個(gè)重要組成部分。每分子細(xì)胞色素C含有一個(gè)血紅素和一條多肽鏈。現(xiàn)已從許多來源獲得細(xì)胞色素C結(jié)晶,并已對100多種細(xì)胞色素C蛋白的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測定。
 
  結(jié)果表明,細(xì)胞色素C的氨基酸殘基的數(shù)目在103~113之間;不同來源細(xì)胞色素C的的氨基酸殘基的順序及含量都有一定的差異。細(xì)胞色素C中賴氨酸含量較高,等電點(diǎn)為10.7,含鐵量為0.38%~0.43%,Mr為12000~13000,豬心細(xì)胞色素C分子量12200。細(xì)胞色素C是一種穩(wěn)定的可溶性蛋白,它易溶于水及酸性溶液,故常用酸性水提取。
 
  細(xì)胞色素C分為氧化型和還原型兩種,氧化型水溶液呈深紅色,還原型水溶液呈桃紅色。細(xì)胞色素C對熱比較穩(wěn)定,不易變性。pH 7.2~10.2,100℃加熱3分鐘,細(xì)胞色素C氧化型和還原型變性程度均為18%~28%,若增加加熱時(shí)間,氧化型的不可逆變性程度比還原型的為高。細(xì)胞色素C對酸堿也較穩(wěn)定,可抵抗0 .3mol/L氫氧化鉀溶液的長時(shí)間處理。一般都將細(xì)胞色素C制成還原型的,因?yàn)楸容^穩(wěn)定并易于保存。
 
  細(xì)胞色素C 是以一種鐵卟啉為輔基的呼吸酶,廣泛存在于所有的需氧組織中。在心肌與其他做劇烈運(yùn)動的肌肉中含量zui為豐富。細(xì)胞色素C 位于線粒體的蛋白質(zhì)—脂質(zhì)絡(luò)合物中,分子量約為13000,肽鏈中含有19個(gè)賴氨酸殘基,為一堿性蛋白, 等電點(diǎn)(10.5~10.8)高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石為鋁酸鈉,它是一種陽離子交換劑,細(xì)胞色素C 分子剛好進(jìn)入它的表面空隙。在pH7.5時(shí)細(xì)胞色素C 呈正電荷,它可與沸石分子上的鈉離子發(fā)生交換,從而被沸石吸附。裝入層析柱后,用25%硫酸銨洗脫,又可將細(xì)胞色素C 交換下來。硫酸銨主要是降低沸石對細(xì)胞色素C 的親和力。硫酸銨鹽析可明顯提高細(xì)胞色素C 純度,主要為去除雜蛋白。另外乙酸可引起細(xì)胞色素C 變性和聚合,必須嚴(yán)格控制酸用量。
 
  細(xì)胞色素C與材料試劑
 
  1、 設(shè)備:組織搗碎機(jī)、酸度計(jì)、離心機(jī)、分光光度計(jì)、層析柱、透析袋、磁力攪拌器、冰箱。
 
  2、 儀器:剪刀、燒杯、漏斗、濾紙、天平、玻璃棒、紗布、試管、膠頭滴管。
 
  3、 試劑:聯(lián)二亞硫酸鈉、硫酸、硫酸銨、、人造沸石、氫氧化銨。
 
  4、 材料:新鮮豬心(2個(gè))。
 
  結(jié)果表明,細(xì)胞色素C的氨基酸殘基的數(shù)目在103~113之間;不同來源細(xì)胞色素C的的氨基酸殘基的順序及含量都有一定的差異。細(xì)胞色素C中賴氨酸含量較高,等電點(diǎn)為10.7,含鐵量為0.38%~0.43%,Mr為12000~13000,豬心細(xì)胞色素C分子量12200。細(xì)胞色素C是一種穩(wěn)定的可溶性蛋白,它易溶于水及酸性溶液,故常用酸性水提取。細(xì)胞色素C分為氧化型和還原型兩種,氧化型水溶液呈深紅色,還原型水溶液呈桃紅色。細(xì)胞色素C對熱比較穩(wěn)定,不易變性。pH 7.2~10.2, 100℃加熱3分鐘,細(xì)胞色素C氧化型和還原型變性程度均為18%~28%,若增加加熱時(shí)間,氧化型的不可逆變性程度比還原型的為高。細(xì)胞色素C對酸堿也較穩(wěn)定,可抵抗0 .3mol/L氫氧化鉀溶液的長時(shí)間處理。一般都將細(xì)胞色素C制成還原型的,因?yàn)楸容^穩(wěn)定并易于保存。
 
  細(xì)胞色素C不是根據(jù)輔基來命名;與其他三類細(xì)胞色素非共價(jià)結(jié)合血紅素不同的是,細(xì)胞色素c通過分子中的半胱氨酸巰基與血紅素共價(jià)結(jié)合。細(xì)胞色素e尚無,但有細(xì)胞色素f(細(xì)胞色素c中的一種)。[3]此外,細(xì)胞色素d僅存在于細(xì)菌中。
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